概述

可調(diào)焦距鏡頭EL-10-30 具有大光圈、快速響應(yīng)和啟動時間以及良好的光學(xué)質(zhì)量等特點，為顯微鏡的各種應(yīng)用提供了廣闊的前景。在本應(yīng)用說明中，我們討論了電動可調(diào)透鏡 (ETL) 在三種不同顯微鏡方法中用于快速軸向聚焦的實施情況：(1) 經(jīng)典寬場熒光顯微鏡，(2) 熒光共聚焦顯微鏡和 (3) 雙光子顯微鏡。

一般考慮因素和典型應(yīng)用

電動可調(diào)焦距透鏡可用于顯微鏡的不同應(yīng)用。其中包括專門的可調(diào)照明系統(tǒng)以及電控變焦光學(xué)系統(tǒng)等。在本應(yīng)用說明中，我們只討論電動可調(diào)焦距透鏡在沿光軸聚焦方面的應(yīng)用。根據(jù)電動可調(diào)焦距透鏡的實現(xiàn)方式和光學(xué)性能要求，可以實現(xiàn)30-700μm的軸向聚焦范圍。不過，在顯微鏡中使用電動可調(diào)透鏡所討論的大多數(shù)技術(shù)細(xì)節(jié)也適用于其他應(yīng)用。在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡中，軸向聚焦通常是通過移動 Z 平臺上的試樣或顯微鏡物鏡來實現(xiàn)的。精確聚焦的常見替代解決方案是使用壓電驅(qū)動物鏡支架。然而，這些聚焦技術(shù)都是基于相對于標(biāo)本的機械軸向移動。如果使用光學(xué)聚焦方案，則可以實現(xiàn)無運動、甚至更快的聚焦。 在顯微鏡的光學(xué)通路中加入電動可調(diào)焦距透鏡是實現(xiàn)光學(xué)聚焦的便捷解決方案。現(xiàn)代顯微鏡物鏡采用無窮遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)，這意味著從物鏡焦平面內(nèi)某一點發(fā)出的光不會聚焦到像平面內(nèi)的某一點，而是作為一束平行光束（聚焦到無窮遠(yuǎn)）從物鏡中射出（圖 1）。要在檢測器上形成真實圖像，還需要額外的管狀透鏡。

圖 1：無限遠(yuǎn)校正物鏡在成像過程中將平行光束聚焦到焦平面上的光點，反之亦然。 位于標(biāo)稱焦平面下方或上方的點光源會分別產(chǎn)生會聚光束或發(fā)散光束。

如果將物體或光源移近物鏡前透鏡，物鏡會產(chǎn)生發(fā)散光束，而將物體放置在比標(biāo)稱工作距離更遠(yuǎn)的地方則會產(chǎn)生會聚光束。這些條件也可以反過來考慮： 如果可以使用可調(diào)光學(xué)元件在物鏡上產(chǎn)生發(fā)散光束或會聚光束，顯微鏡就可以沿光軸聚焦。這既適用于照明，也適用于通過物鏡的成像光路，如激光掃描顯微鏡。

由于液態(tài)鏡頭EL-10-30 只能產(chǎn)生可調(diào)諧的會聚光束，因此必須搭配負(fù)焦距的偏置透鏡，才能實現(xiàn)從負(fù)焦距到正焦距的調(diào)諧范圍（圖 2）。我們將焦距為 -100mm的平凹單透鏡與 液態(tài)鏡頭EL-10-30（低色散變體，焦距范圍為50-200mm）組合在一起。電動可調(diào)焦距透鏡和偏置透鏡 (OL) 的組合可安裝在定制透鏡架或標(biāo)準(zhǔn) 30 mm透鏡管中。

圖 2：EL-10-30 (電動可調(diào)透鏡) 和負(fù)焦距偏置透鏡 (OL) 的 ZEMAX 模型（f= 100mm，Thorlabs LC4232）。請注意可調(diào)表面曲率的變化以及由此產(chǎn)生的光束發(fā)散變化。

實現(xiàn)光學(xué)聚焦的最簡單方法是將 ETL/OL 組件盡可能靠近物鏡安裝（圖 3）。例如，可以將 ETL 和 OL 安裝在帶有兩個有效值螺紋的鏡筒中，并插入物鏡轉(zhuǎn)舌器和物鏡之間，這與插入壓電聚焦裝置的方式相同。

圖 3：ETL/OL組件與顯微鏡物鏡相結(jié)合（USP 4231637）。整個系統(tǒng)的軸向長度約為50mm。在該系統(tǒng)中，EL-10-30的焦距從150mm移動到80mm，會導(dǎo)致軸向焦距在標(biāo)稱工作距離周圍發(fā)生-50 μm到 +50μm的移動。物鏡焦距為4.4 mm。

將 ETL 和 OL 放置在靠近物鏡后擋板的位置既直接又簡單，但這并不是光學(xué)聚焦的最佳位置，也不適合所有成像應(yīng)用。大多數(shù)顯微鏡物鏡都是遠(yuǎn)心的，這意味著每束射線中的中心射線（如圖 3 中紅色的軸上射線），也稱為主射線，在離開物鏡前透鏡后沿光軸傳播。將 ETL 放在靠近物鏡的位置進(jìn)行聚焦會導(dǎo)致非遠(yuǎn)心條件（圖 4）。其結(jié)果是，如果軸向聚焦位置發(fā)生變化，視場（FOV）大小或放大倍率也會發(fā)生變化。如果所需的焦點偏移很小（< 50μm），則可以忍受。另外，ETL/OL 組件也可以通過 4f 中繼系統(tǒng)（例如由兩個消色差組成的 4f 系統(tǒng)）定位在顯微物鏡的共軛瞳孔平面上，因為大多數(shù)物鏡都有一個無法觸及的擋板（圖 5）。

圖 4：顯微鏡物鏡前透鏡上的兩條射線束在樣品的不同側(cè)向點聚焦。左圖顯示了遠(yuǎn)心條件下的兩條射線束--中央綠色（主射線）平行于光軸傳播（藍(lán)色主射線）。中間和右圖顯示的是使用同一物鏡聚焦，ETL/OL 靠近其后擋板的情況。斜（紅色）射線束的主射線并不平行于光軸傳播，因此，如果焦平面移動到更靠近物鏡的位置（導(dǎo)致放大倍率或 FOV 大小改變），紅色和藍(lán)色焦點之間的距離就會增加。

圖 5：保持遠(yuǎn)心成像條件的 4f 中繼系統(tǒng)布局示例。ETL/OL 組件（左側(cè)）通過中間部分由兩個 f=100mm消色差組成的 4f 系統(tǒng)放置在物鏡（日本專利 8-292374；右側(cè)）的共軛瞳孔平面上。瞳孔（紅光束和藍(lán)光束的交點）被重新成像到物鏡中。該系統(tǒng)的總長度約為 380 mm。要生成圖像，系統(tǒng)左側(cè)需要一個管狀透鏡。在基于 ETL 的聚焦過程中，中間焦平面會發(fā)生移動。

不過，大多數(shù)商用顯微鏡不允許將中繼系統(tǒng)插入光路。在這種情況下，將中繼系統(tǒng)置于相機或激光端口可能是一種選擇。

電動可調(diào)焦距鏡頭EL-10-30 的控制方式

通過使用激光二極管的精密恒流驅(qū)動器（例如 Edmund Optics NT56-804、Thorlabs LD1255R）和 0-250 mA可編程模擬輸出，可以輕松實現(xiàn)對 EL-10-30 的計算機控制。對于簡單的聚焦應(yīng)用，只需將控制電流與聚焦位置相關(guān)聯(lián)的校準(zhǔn)查找表即可（請參見圖 15）。

兩種實施方式概述如下：

應(yīng)用實例： 寬視場顯微鏡

就視覺使用而言，聚焦時視場角或放大倍率的變化會造成混淆（因為其視覺外觀相當(dāng)于變焦效果）。如果對焦增量較小（幾微米），這種情況還可以忍受，否則就會造成干擾。在這種情況下，有必要將 ETL/OL 組件置于共軛瞳孔位置。在大多數(shù)顯微鏡中，必須在光路中插入一個定制模塊，其中包含附加的中繼光學(xué)元件和 ETL/OL 組件。在典型的直立式顯微鏡中，停止位置位于物鏡內(nèi)部，無法觸及，因此必須使用中繼系統(tǒng)。然而，在倒置顯微鏡中，顯微鏡機身內(nèi)部的光學(xué)元件通常會形成一個共軛瞳孔，在某些類型的顯微鏡中，這個瞳孔是可觸及的，并且位于光路的垂直部分，因此非常適合插入基于 ETL 的聚焦系統(tǒng)。20 世紀(jì) 80 年代的蔡司 Axiovert 35 就是這樣一款顯微鏡，如圖 6 所示。

安裝

通過將 ETL/OL 組件插入 30 mm的鏡筒，并將其固定在光學(xué)導(dǎo)軌上（圖 8），使其靠近瞳孔。為了定位瞳孔位置，可以使用一個簡單的技巧： 將用于相位顯微鏡的相位掩膜重新成像到共軛瞳孔平面。在聚光鏡或物鏡中形成相位掩膜清晰圖像的位置就是 ETL 的理想位置（圖 8 中的插圖）。這種基于 ETL 的聚焦方式還有一個優(yōu)點，即 ETL 可用于多種物鏡。根據(jù)物鏡的不同，ETL 和 OL 的最佳位置可能會有所偏移，因為某些類型的物鏡在瞳孔成像特性上有所不同。

圖 6：Axiovert 35 顯微鏡的光路。ETL/OL 組件可放置在瞳孔處，無需插入額外的中繼系統(tǒng)。TL：管狀透鏡。

圖 7：Axiovert 35 顯微鏡，取下側(cè)蓋可進(jìn)入瞳孔。圖 6 中顯示的部分光學(xué)元件突出顯示。

圖 8：在共軛瞳孔位置插入 ETL/OL 組件。ETL 和 OL 安裝在連接到光學(xué)導(dǎo)軌的支柱上。插圖： 共軛瞳孔位置可通過尋找相位環(huán)的清晰圖像來確定。

結(jié)果

結(jié)合使用 40x NA 0.6 物鏡（Zeiss LD Achroplan 40x / 0.6 Korr Ph2），可實現(xiàn)最大 120μm的散焦范圍（校正環(huán)設(shè)置在固定位置）。圖 9 顯示了用 ETL 聚焦采集到的一組花粉粒的 Z 疊圖像示例（表熒光模式）。

圖 9：通過一組花粉粒進(jìn)行基于 ETL 的聚焦。相對于標(biāo)稱圖像平面，圖像范圍從 -30μm到 + 25μm。由于 ETL 位于共軛瞳孔處，因此放大倍數(shù)沒有變化。比例尺：100μm。

應(yīng)用示例 共聚焦顯微鏡

共聚焦顯微技術(shù)是最重要的顯微技術(shù)之一，在細(xì)胞生物學(xué)、單分子物理學(xué)和許多其他領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)
用。

安裝

標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡是高度集成的系統(tǒng)，無法訪問或插入光路中的大部分光學(xué)元件。根據(jù)具體的顯微鏡，可以采用不同的解決方案插入 ETL/OL 組件。一種方法是，如果共焦成像不需要濾光器立方體，則將 ETL/OL 組件安裝在顯微鏡支架濾光器轉(zhuǎn)塔中的定制濾光器立方體中。另外，也可以將 ETL 安裝在中繼系統(tǒng)中（圖 10）。

我們使用的顯微鏡1（圖 11）是一臺旋轉(zhuǎn)盤共焦儀，共焦單元（橫河 CSU X1）和 CCD 攝像機連接到奧林巴斯 IX-71 的側(cè)端口。這種顯微鏡配置允許將包含 ETL 和 OL 的改裝原始濾光片盒插入濾光片轉(zhuǎn)塔，而無需對顯微鏡進(jìn)行大量改裝。在操作過程中，只需將濾光片轉(zhuǎn)塔旋轉(zhuǎn)到空位，即可將 ETL 從光路中移除。

圖 10：在典型的倒置激光掃描顯微鏡中實現(xiàn)基于 ETL 的聚焦的三種不同方案。(1) ETL/OL 可以像壓電式聚焦裝置一樣放置在顯微鏡物鏡和物鏡轉(zhuǎn)塔之間。(2) 如果可能，可將 ETL 和 OL安裝在定制的濾光片立方體中。這兩種方法都有一個共同的缺點，即在聚焦過程中放大倍率可能會發(fā)生顯著變化。(3) 為了避免這種情況，可以在共焦掃描裝置和顯微鏡支架之間插入一個中繼系統(tǒng)。為使系統(tǒng)達(dá)到最佳性能，ETL 應(yīng)位于光路的垂直部分，否則，由重力引起的可調(diào)諧膜的不對稱變形可能會導(dǎo)致圖像質(zhì)量下降。

圖 11：在共聚焦顯微鏡中實現(xiàn) ETL 和 OL。(a) 旋轉(zhuǎn)盤裝置安裝在顯微鏡支架的左側(cè)端口。藍(lán)色 CCD 相機用于成像。驅(qū)動 ETL 的電流轉(zhuǎn)換器由函數(shù)發(fā)生器控制。ETL/OL 組件安裝在定制的濾光器立方體 (b) 中，并插入濾光器轉(zhuǎn)塔 (c)。濾鏡轉(zhuǎn)塔重新插入顯微鏡支架，就在物鏡轉(zhuǎn)塔的下方。

結(jié)果

結(jié)合使用 40x NA 1.3 物鏡（奧林巴斯 UPLFLN 40XO），可以實現(xiàn) 60μm的 z 范圍。圖 12 顯示了花粉粒（直徑 100 μm）z-stack 的單張切片。

圖 12：花粉粒（直徑 100μm）的 Z 疊圖，范圍為 60μm。圖中標(biāo)出了相對于第一幅圖像的 Z 位置。比例尺： 50μm。

圖 13：圖 9 所示數(shù)據(jù)的最大強度投影。

應(yīng)用實例： 雙光子顯微鏡

雙光子激發(fā)技術(shù)在散射介質(zhì)中具有出色的成像能力，因此非常適合在組織深處進(jìn)行熒光成像。結(jié)合神經(jīng)元活動的功能指標(biāo)和活體成像方案，雙光子顯微鏡是記錄活體小鼠大腦深處十分之一到數(shù)百個神經(jīng)元群體活動的標(biāo)準(zhǔn)方法。神經(jīng)元分布在整個體積中，對單個焦平面進(jìn)行取樣只能提供局部網(wǎng)絡(luò)中整個活動的提示。因此，我們需要快速、簡單的三維顯微鏡技術(shù)，而 ETLs 的使用提供了一種非常簡單直接的方法。事實上，ETLs和雙光子顯微鏡是一種理想的組合，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

• 在大多數(shù)雙光子顯微鏡中，只需在激發(fā)路徑上實施光學(xué)聚焦方案即可實現(xiàn)軸向掃描。這是由于雙光子顯微鏡采用了非線性激發(fā)過程，只能在焦點處激發(fā)熒光團。通過改變激發(fā)光束來沿軸向和橫向移動焦點，就足以實現(xiàn)三維雙光子激光掃描顯微鏡。

• 激發(fā)激光的波長為近紅外波長，在我們的顯微鏡中為 850nm。長波長可容忍在可見光波長下會嚴(yán)重降低圖像質(zhì)量的波前像差。

• 激發(fā)激光的光譜帶寬較小（10 nm FWHM），這限制了非色差 ETL/OL 組合可能帶來的色差影響。

• 對于大多數(shù)測量功能細(xì)胞活動的生物應(yīng)用而言，安裝在物鏡附近的 ETL/OL 組件所帶來的視場尺寸變化不會干擾測量。要記錄功能數(shù)據(jù)，激光必須在一段時間內(nèi)反復(fù)對準(zhǔn)同一組細(xì)胞。如果由于放大倍率的變化，細(xì)胞之間的距離變遠(yuǎn)，則會選擇相應(yīng)的點進(jìn)行掃描。

安裝

與定制的雙光子顯微鏡結(jié)合使用的裝置如圖 14 所示。

圖 14：ETL/OL 組件在雙光子顯微鏡中的應(yīng)用。(a) ETL 和 OL 安裝在一個定制的物鏡架上，物鏡架連接到顯微鏡的檢測系統(tǒng)上。利用可移動的二色性 DC，可將發(fā)射的熒光引導(dǎo)至背景中的檢測系統(tǒng)。物鏡架底部有一個 RMS 螺紋，可安裝奧林巴斯 LUMPlanFl/IR 40x NA 0.8 水浸物鏡。(b) 安裝在定制支架內(nèi)的 ETL 和 OL的剖面圖。(c) 直接觀察熒光素溶液中的雙光子激發(fā)焦點。結(jié)合 40 倍物鏡，焦點（綠色細(xì)長光斑）的移動范圍可達(dá) 700 μm。

結(jié)果

通過在 50 至 200mm之間調(diào)整 ETL 的焦距，可以實現(xiàn)高達(dá) 700μm的軸向聚焦。物鏡的工作距離（名義上為 3.3 mm）相應(yīng)地從 2.8mm變?yōu)?3.41mm。對于大多數(shù)成像應(yīng)用來說，更小的范圍就足夠了。

圖 15：軸向焦距偏移（40 倍物鏡，-100mm偏置透鏡）與 ETL 控制電流的關(guān)系。這組校準(zhǔn)值被用作查找表，以便對焦到所需位置。

圖 16：用顯微鏡電動 Z 平臺測量的花粉粒在不同軸向焦距位移下未經(jīng) ETL 重新聚焦（左圖）和經(jīng) ETL 重新聚焦后的圖像。請注意放大倍率/視場大小的變化。刻度線： 5μm。

應(yīng)用實例： 檢測顯微鏡

在使用標(biāo)準(zhǔn)鏡頭組件的檢測顯微鏡中，可調(diào)諧鏡頭通常位于無窮遠(yuǎn)校正物鏡和管狀鏡頭之間。下面的示例概述了將 EL-10-30-Ci 與 Qioptiq 的 Optem 微型檢測鏡頭相結(jié)合的現(xiàn)成系統(tǒng)。所有部件都有 C 型安裝螺紋，因此可以完美配合。下表概述了實現(xiàn)的 Z 范圍和分辨率。

圖 17：使用現(xiàn)成組件的高倍率檢測系統(tǒng)示例。圖中顯示的是放大 7.9 倍的印刷電路板（軌跡寬度為 10μm）

在顯微鏡中使用電動可調(diào)透鏡

• 在光束路徑的哪個位置插入 ETL/OL 組件？是否可以到達(dá)這個位置？

• 是否可以將 ETL/OL 組件垂直放置在光路內(nèi)的地面上，以避免電動可調(diào)透鏡表面因重力而出現(xiàn)任何不對稱形狀？

• 光束是否足夠小，以匹配 EL-10-30 的 10mm孔徑？（這也適用于共軛瞳孔的大小。）如果不需要電動聚焦，請考慮使用手動可調(diào)鏡頭 ML-20-35，其自由孔徑為 20mm。

• 您需要達(dá)到哪個聚焦范圍？在大多數(shù)情況下，使用電動可調(diào)透鏡的光學(xué)聚焦需要輔以機械聚焦裝置，才能達(dá)到所需的范圍。電動可調(diào)透鏡非常適合使用中高 NA 物鏡實現(xiàn)從十分之一到數(shù)百微米的聚焦范圍。使用低倍率、低凈空系數(shù)（NA）物鏡，聚焦范圍似乎可以達(dá)到 1mm。

• 必須滿足哪些光學(xué)性能要求？例如，在雙光子顯微鏡中，準(zhǔn)單色的近紅外激發(fā)光可以降低對色差和其他像差的校正要求，從而獲得數(shù)百微米的聚焦范圍，這正是活體大腦成像所需要的。另一面，典型的共聚焦顯微鏡在光學(xué)校正方面的要求要高得多，但典型的樣本尺寸也要小得多（十分之一微米），這使得 ETLs能夠成功應(yīng)用于某些應(yīng)用。對整個顯微鏡進(jìn)行光學(xué)模擬，通常可以使電動可調(diào)透鏡介導(dǎo)的聚焦符合必要的要求。

• 目標(biāo)對焦速度是多少？EL-10-30 的快速對焦已得到證實（使用 40x NA 0.8 物鏡，15ms內(nèi)對焦移動100 μm，相當(dāng)于焦距從 108 mm變?yōu)?82mm）。